Jedną z głównych zalet hodowli komórkowych jest możliwość manipulowania chemią fizyczną reprodukcji komórek (tj. temperaturą, pH, ciśnieniem osmotycznym, napięciem O2 i CO2) oraz środowiskiem fizjologicznym (tj. stężeniem hormonów i składników odżywczych).Oprócz temperatury środowisko hodowli jest kontrolowane przez pożywkę wzrostową.
Chociaż fizjologiczne środowisko hodowli nie jest tak jasne, jak jej środowisko fizyczne i chemiczne, lepsze zrozumienie składników surowicy, identyfikacja czynników wzrostu wymaganych do proliferacji oraz lepsze zrozumienie mikrośrodowiska komórek w hodowli.(tj. interakcja komórka-komórka, dyfuzja gazu, interakcja z matrycą) umożliwia obecnie hodowlę pewnych linii komórkowych w pożywce wolnej od surowicy.
1. Środowisko kultury wpływa na wzrost komórek
Należy pamiętać, że warunki hodowli komórkowej są różne dla każdego typu komórek.
Konsekwencje odstępstwa od warunków hodowli wymaganych dla określonego typu komórek obejmują ekspresję nieprawidłowych fenotypów, a nawet całkowite niepowodzenie hodowli komórkowej.Dlatego zalecamy zapoznanie się z interesującą Cię linią komórkową i ścisłe przestrzeganie instrukcji podanych dla każdego produktu, którego używasz w swoim eksperymencie.
2. Środki ostrożności dotyczące tworzenia zoptymalizowanego środowiska hodowli komórkowej dla komórek:
Pożywka hodowlana i surowica (więcej informacji znajduje się poniżej)
Poziomy pH i CO2 (więcej informacji znajduje się poniżej)
Kultywuj plastik (więcej informacji znajdziesz poniżej)
Temperatura (więcej informacji poniżej)
2.1 Media kulturowe i surowica
Pożywka hodowlana jest najważniejszą częścią środowiska hodowlanego, ponieważ dostarcza składników odżywczych, czynników wzrostu i hormonów potrzebnych do wzrostu komórek oraz reguluje pH i ciśnienie osmotyczne kultury.
Chociaż wstępne eksperymenty z hodowlami komórkowymi przeprowadzono przy użyciu naturalnych pożywek uzyskanych z ekstraktów tkankowych i płynów ustrojowych, potrzeba standaryzacji, jakości pożywek i zwiększonego zapotrzebowania doprowadziły do opracowania ostatecznych pożywek.Trzy podstawowe typy pożywek to pożywki podstawowe, pożywki o obniżonej zawartości surowicy i pożywki bez surowicy, które mają różne wymagania dotyczące suplementacji surowicą.
2.1.1 Medium podstawowe
Pożywka do hodowli komórkowych Gibco
Większość linii komórkowych dobrze rośnie w podstawowych podłożach zawierających aminokwasy, witaminy, sole nieorganiczne i źródła węgla (takie jak glukoza), ale te podstawowe preparaty muszą być uzupełnione surowicą.
2.1.2 Pożywka ze zredukowaną surowicą
Butelka z Gibco Low Serum Medium
Inną strategią zmniejszania niekorzystnych skutków surowicy w doświadczeniach z hodowlą komórkową jest stosowanie pożywek o obniżonej zawartości surowicy.Pożywka o zredukowanej surowicy to podstawowa formuła pożywki bogata w składniki odżywcze i czynniki pochodzenia zwierzęcego, które mogą zmniejszyć wymaganą ilość surowicy.
2.1.3 Podłoże bez surowicy
Butelka z pożywką Gibco bez surowicy
Pożywka bez surowicy (SFM) pozwala uniknąć stosowania surowicy zwierzęcej poprzez zastąpienie surowicy odpowiednimi preparatami odżywczymi i hormonalnymi.Wiele pierwotnych kultur i linii komórkowych ma formuły pożywek bez surowicy, w tym linia do produkcji rekombinowanego białka jajnika chomika chińskiego (CHO), różne linie komórkowe hybrydoma, linie owadów Sf9 i Sf21 ( Spodoptera frugiperda ), a także gospodarz do produkcji wirusów (na przykład 293, VERO, MDCK, MDBK) itp. Jedną z głównych zalet stosowania podłoża bez surowicy jest możliwość uczynienia podłoża selektywnym względem określonych typów komórek poprzez wybranie odpowiedniej kombinacji czynników wzrostu.W poniższej tabeli wymieniono zalety i wady pożywek bez surowicy.
Korzyść
Zwiększ przejrzystość
Bardziej spójna wydajność
Łatwiejsze oczyszczanie i dalsze przetwarzanie
Dokładna ocena funkcji komórek
Zwiększ produktywność
Lepsza kontrola reakcji fizjologicznych
Ulepszone wykrywanie mediów komórkowych
Niekorzyść
Wymagania dotyczące formuły pożywki specyficznej dla typu komórek
Potrzebujesz wyższej czystości odczynnika
Spowolnienie wzrostu
2.2.1 Poziom pH
Większość normalnych linii komórkowych ssaków rośnie dobrze przy pH 7,4, a różnice między różnymi liniami komórkowymi są niewielkie.Wykazano jednak, że niektóre transformowane linie komórkowe rosną lepiej w lekko kwaśnym środowisku (pH 7,0 – 7,4), podczas gdy niektóre normalne linie komórkowe fibroblastów preferują środowisko lekko zasadowe (pH 7,4 – 7,7).Linie komórkowe owadów, takie jak Sf9 i Sf21, rosną najlepiej przy pH 6,2.
2.2.2 Poziom CO2
Pożywka wzrostowa kontroluje pH hodowli i buforuje komórki w hodowli, aby oprzeć się zmianom pH.Zazwyczaj takie buforowanie uzyskuje się przez dodanie buforów organicznych (na przykład HEPES) lub CO2-wodorowęglanów.Ponieważ pH pożywki zależy od delikatnej równowagi rozpuszczonego dwutlenku węgla (CO2) i wodorowęglanu (HCO3-), zmiany atmosferycznego CO2 zmienią pH pożywki.Dlatego w przypadku stosowania pożywki buforowanej buforem na bazie CO2-wodorowęglanów konieczne jest stosowanie egzogennego CO2, zwłaszcza w przypadku hodowli komórek w otwartych szalkach lub hodowli transformowanych linii komórkowych w wysokich stężeniach.Chociaż większość badaczy zwykle używa 5-7% CO2 w powietrzu, większość eksperymentów z hodowlami komórkowymi zwykle wykorzystuje 4-10% CO2.Jednak każde podłoże ma zalecane ciśnienie CO2 i stężenie wodorowęglanów, aby osiągnąć prawidłowe pH i ciśnienie osmotyczne;więcej informacji można znaleźć w instrukcjach producenta nośnika.
2.3 Uprawa tworzyw sztucznych
Tworzywa sztuczne do hodowli komórkowych są dostępne w różnych formach, rozmiarach i powierzchniach, aby pasowały do różnych zastosowań w hodowli komórkowej.Skorzystaj z poniższego przewodnika po plastikowych powierzchniach do hodowli komórek i przewodnika po pojemnikach do hodowli komórkowych, aby wybrać odpowiedni plastik do zastosowania w hodowli komórkowej.
Zobacz wszystkie tworzywa sztuczne do hodowli komórek Thermo Scientific Nunc (link reklamowy)
2.4 Temperatura
Optymalna temperatura hodowli komórkowej zależy w dużym stopniu od temperatury ciała żywiciela, z którego komórki są izolowane, a w mniejszym stopniu od anatomicznych zmian temperatury (np. temperatura skóry może być niższa niż temperatura mięśnia szkieletowego ).W przypadku hodowli komórkowych przegrzanie jest poważniejszym problemem niż przegrzanie.Dlatego temperatura w inkubatorze jest zwykle ustawiana nieco poniżej temperatury optymalnej.
2.4.1 Optymalna temperatura dla różnych linii komórkowych
Większość ludzkich i ssaczych linii komórkowych utrzymuje się w temperaturze od 36°C do 37°C w celu zapewnienia optymalnego wzrostu.
Komórki owadów hoduje się w temperaturze 27°C dla optymalnego wzrostu;rosną wolniej w niższych temperaturach i temperaturach między 27°C a 30°C.Powyżej 30°C żywotność komórek owadzich spada, nawet jeśli wróci do 27°C, komórki nie zregenerują się.
Ptasie linie komórkowe potrzebują 38,5°C, aby osiągnąć maksymalny wzrost.Chociaż komórki te można przechowywać w temperaturze 37°C, będą rosły wolniej.
Linie komórkowe pochodzące od zwierząt zmiennocieplnych (takich jak płazy, ryby zimnowodne) tolerują szeroki zakres temperatur od 15°C do 26°C.
Czas postu: 01-02-2023